一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念

（1）基本概念

細(xì)胞培養(yǎng)：狹義的細(xì)胞培養(yǎng)主要是指分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)還包括單（個(gè)）細(xì)胞培養(yǎng)又稱克隆（clone），是指單個(gè)細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

原代培養(yǎng)：即第一次培養(yǎng)，指將培養(yǎng)物放在體外生長(zhǎng)環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。

傳代：原代培養(yǎng)成功后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸發(fā)生接觸性抑制，生長(zhǎng)速度減慢甚至停止；另一方面因營(yíng)養(yǎng)物不足和代謝物積累不利于生長(zhǎng)或發(fā)生中毒。需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程稱為傳代或者再培養(yǎng)。

細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首傳代成功后，即成細(xì)胞系。如細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細(xì)胞系，它由原代培養(yǎng)中的許多細(xì)胞系列組成。如細(xì)胞系可連續(xù)傳代，則稱為連續(xù)細(xì)胞系，即已建成的細(xì)胞系。

細(xì)胞株：通過篩選或克隆化，且有特殊性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞。這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。這些特性包括具有一定的標(biāo)記染色體，對(duì)某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。 

三、常用的器材與試劑

（1）常用儀器

超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。

濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。

電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2h）。主要用干玻璃器皿消毒。

壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣。

CO2培養(yǎng)箱:CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件:37℃，5%CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：

①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。

②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h）。

③箱內(nèi)火菌蒸餾水 3000ml 蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。

其它儀器：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，液氮罐，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀等。

（2）常用耗材

耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，培養(yǎng)板，凍存管，酒精燈

（3）常用試劑

• 消化液

胰蛋白酶：是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%。用濾器過濾除菌，如經(jīng)費(fèi)充裕可以直接購(gòu)買已經(jīng)配制好的胰酶，無需自己配制。

胰蛋白酶作用機(jī)制：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。

胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10 min?？捎煤迮囵B(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。

• 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）：是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。

天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。

合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定，成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要，只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

• 血清培養(yǎng)基

血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分。

常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量為好。

血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30min。血清的消毒：過濾除菌。

• 抗菌素的使用

抗生素的作用：在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素最終使用濃度為每毫升100單位，方便、廣譜、穩(wěn)定。

• 完培的組成

基礎(chǔ)培養(yǎng)基80%一95%，血清5%-20%，碳酸氫鈉2.0g/L，青、鏈霉素各100單位/毫升。

四、細(xì)胞的傳代方式

（1）懸浮細(xì)胞

直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。

離心法傳代：離心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。

（2）半懸浮細(xì)胞

此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。

（3）貼壁細(xì)胞

采用酶消化法傳代，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

詳細(xì)步驟:

1、吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入1-2ml PBS清洗2-3遍，吸出PBS。

2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液，以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)。

3、靜置2-10min（具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)確定），顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，當(dāng)細(xì)胞消化全，立即加入含血清培養(yǎng)基，終止消化。

4、轉(zhuǎn)移至離心管，離心（800r/min，5min）。

5、吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞沉淀，混勻，形成細(xì)胞懸液。

6、吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

7、加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

（1）凍存和復(fù)蘇的原則

慢凍快融，當(dāng)細(xì)胞冷到0℃以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

（2）慢凍程序

方法一：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，-1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，-5~-10℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存。

方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序之程序降溫機(jī)中每分鐘降-1～-3℃至-80℃以下，再放入液氮長(zhǎng)期保存。

方法三：購(gòu)買無血清快速細(xì)胞凍存液，可以省掉程序降溫的步驟，直接凍存。補(bǔ)充：一般凍存液的配置：90%血清+10%DMSO。

（3）基低溫保護(hù)劑的應(yīng)用

在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

（4）細(xì)胞凍存步驟

1、預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?，用吸管吹打制成?xì)胞懸液（1×106~5×106細(xì)胞/ml）

3、加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。

4、按照慢凍程序?qū)?xì)胞進(jìn)行凍存。

（5）細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1、從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴鍋，使其融化（1分鐘左右）。

2、立即轉(zhuǎn)移至離心管，加入適量培養(yǎng)液。

3、以800r/min離心5分鐘。

4、去上清，加新鮮培養(yǎng)液，吹打混勻成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

六、細(xì)胞計(jì)數(shù)

（1）人工計(jì)數(shù)法

吹打待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞，使其在懸液內(nèi)分布均勻，這樣只需測(cè)定很小一部分體積的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

酒精消毒計(jì)數(shù)板：用酒精棉將細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片全擦拭干凈，并將蓋玻片蓋于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上；

轉(zhuǎn)移蓋玻片：吸取10 ul單細(xì)胞懸液，并沿著蓋玻片邊緣滴加，使細(xì)胞懸液填滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間區(qū)域，注意避免產(chǎn)生氣泡，細(xì)胞懸液亦不能流入計(jì)數(shù)板的邊槽中，之后靜置3 min；

數(shù)細(xì)胞：隨機(jī)選取計(jì)數(shù)板上其中4大格并記錄4大格中的細(xì)胞總數(shù)，壓線的細(xì)胞按照數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則，之后按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)／mL=4大格細(xì)胞總數(shù)／4×104×稀釋倍數(shù)

七、注意事項(xiàng)

（1）注意事項(xiàng)

計(jì)數(shù)前：計(jì)數(shù)前，注意吸盡培養(yǎng)皿里的細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)：實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。

吸管：吸取過營(yíng)養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入營(yíng)養(yǎng)液中。

手：不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內(nèi)部，吸管前部等所有可能與細(xì)胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

火焰滅菌時(shí)間：開啟、關(guān)閉長(zhǎng)有細(xì)胞的培養(yǎng)瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過高燒死細(xì)胞。

換液：換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過快，防止廢液四濺。

吹打細(xì)胞：吹打細(xì)胞時(shí)，要注意邊角的細(xì)胞是否吹打下來。

相對(duì)較臟的物品:手或相對(duì)較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上，即不可以在開放容器上方操作。

交叉污染:每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。

自身的安全:注意自身的安全，對(duì)于來自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心。操作過程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

凍存:從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。凍存和復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。

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