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    淋巴細(xì)胞的分離

    發(fā)布時間: 2022-12-09  點(diǎn)擊次數(shù): 1014次

    原理

    通過右旋糖酐促沉降作用去除紅血細(xì)胞后,將枸櫞酸或肝素抗凝的全血或血漿層加在致密的 Ficoll-Hypaque 層上面。離心后,大部分淋巴細(xì)胞位于 Ficoll-Hypaque 和血漿之間的界面。

    材料與儀器

    肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本 D-PBSA Ficoll-Hypaque
    無血清培養(yǎng)液
    帶有鈍頭插管的注射器 塑料Pasteur吸管或移液器 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器 離心機(jī)

    步驟

    1. 用枸櫞酸或肝素抗凝容器采集血液標(biāo)本(肝素或枸櫞酸抗凝的血液樣本,枸櫞酸或肝素的濃度依收集容器而定。透明的離心管或普通容器),然后送到實(shí)驗(yàn)室。

    2. 用 D-PBSA 按 1:1 稀釋后,將 9 ml 血液加在 6 ml Ficoll-Hypaque (將比重調(diào)整為 1.077 g/cc)上。使用帶蓋的粗大透明離心管如 25 ml Sterilin 或 Nimc 普通容器,或在 50 ml 透明的塑料 Corning 離心管中加入雙倍的液量。

    3. 離心(400 g,15 min),這是在界面中心測量的離心速率。

    4. 不要攪動界面,小心地吸出血漿和 D-PBSA 層。

    5. 帶有鈍頭插管的注射器或塑料巴斯德吸管收集含有淋巴細(xì)胞的液層,然后用無血清培養(yǎng)液如 RPMI 1640 將其稀釋至 20 ml。

    6. 將稀釋的細(xì)胞懸液離心(70 g,10 min)。

    7. 棄去上淸液,用 2 ml 無血清培養(yǎng)液混懸沉降細(xì)胞。如果需要洗幾次(如除去血清因子),可再用 20 ml 無血清培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,離心 2 次或 3 次。最后,用 2 ml 無血清培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞。

    8. 取一份細(xì)胞樣本,用美藍(lán)染色,然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)有核細(xì)胞。取另一份細(xì)胞樣本,用 Zapoglobin (Beckman Coulter) 溶解,利用 70~100 μm 口徑的管在電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)細(xì)胞核。

    淋巴細(xì)胞與一些血小板和單核細(xì)胞集中于一層。雖然在步驟 3 離心的大部分粒細(xì)胞主要見于 Ficoll-Hypaque 中,但有些粒細(xì)胞可位于淋巴細(xì)胞層。通過利用單核細(xì)胞和粒細(xì)胞附著玻璃(微珠或培養(yǎng)瓶內(nèi)表面)或尼龍網(wǎng)的特點(diǎn),能將單核細(xì)胞和殘留的粒細(xì)胞從淋巴細(xì)胞層中除去。如果需要分離更純的細(xì)胞,可利用特異性淋巴細(xì)胞亞群的表面標(biāo)志物,用 MACS 或 FACS 進(jìn)行陽性分選。

    注意事項(xiàng)

    1. 人的血液可能受到 HIV 、肝炎病毒或其他病原體等的感染,在操作時應(yīng)當(dāng)特別小心。

       2. 不要用玻璃 Pasteur 吸管和帶有銳利針頭的注射器加注入的血液,但可用 1 ml 移液器或帶有鈍頭插管的注射器。





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