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    原代細胞培養(yǎng)入門

    發(fā)布時間： 2024-04-22　　點擊次數(shù)： 492次

    大家好！這篇文章是關于原代培養(yǎng)的入門知識，向剛入門的同學科普這個實驗的基礎。


    包括以下內容：

    1. 原代培養(yǎng)的概念和流程

    2. 分離組織的操作和注意事項

    3. 解離組織獲取細胞的三種常見方法


    原代培養(yǎng)是指細胞分離之后至第一次傳代之前的細胞培養(yǎng)階段，之后細胞就轉變成細胞系。


    原代培養(yǎng)可分為4個步驟：

    1. 獲取樣品

    2. 分離組織

    3. 解剖或解離組織

    4. 接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)


    用于原代培養(yǎng)的樣品中可來源于2類，一是實驗室樣本，包括實驗動物的器官、組織，例如胚胎、腸道等；二是臨床樣本，例如通過手術過程分離出來的病人組織。

    分離組織

    分離組織的時候，要注意無菌操作，在無菌環(huán)境下切除組織，并將其至于PBS緩沖液或運輸專用的培養(yǎng)基中轉移至下一步操作的實驗室內。
    另外，分離組織時有2個小技巧：
    1. 在取材時可以盡量多去除脂肪和壞死的組織。
    2. 使用鋒利的手術刀將組織切碎，以減小對組織的損傷

    獲取細胞

    獲取組織之后，我們要把細胞從組織中分離出來繼續(xù)生長，這個操作可分為兩種:

    1.將組織塊貼附于適宜的基質中，細胞可從組織塊向外遷移生長，這個操作過程叫原代外植;


    2.將組織塊用機械法或酶消化法處理獲得細胞懸液，接種細胞懸液，其中部分細胞最終將黏附于基質開始生長。

    原代細胞培養(yǎng)入門


    如果所取組織很小，則適于用原代外植法；如果組織較大，可用酶消化法以獲得更多的細胞。


    軟的組織適合于用機械法解離，一些硬的組織，如果產物的多少并不重要，或者從纖維間質組


    織分離松散黏附的細胞，也可用機械法分離。

    下圖是不同處理方法的路線圖，同學們可以用于參考。
    原代細胞培養(yǎng)入門
    相對于原代外植，酶處理或機械法分離出細胞可以有效避免細胞因遷移率不同而選擇性生長的問題。
    同時，酶解法可以在比較短的時間內培養(yǎng)出大量的細胞，因此，在實驗室中較常見，我們選擇這兩種方法來詳細講解。

    胰蛋白酶處理

    酶處理方法主要分為胰蛋白酶和膠原酶處理，而胰蛋白酶的反應條件來劃分又可以分為冷胰蛋白酶和溫胰蛋白酶兩種。

    溫胰蛋白酶消化技術適于在相對短的時間消化大的組織，尤其對于整個小鼠胚胎或雞胚。
    由于成年組織含有大量纖維結締組織，故對成年組織效果不好，機械攪拌可損傷較敏感的細胞，如上皮細胞。
    用胰蛋白酶消化組織的缺點之一是于 37度條件下長期作用可損傷細胞，因此采用溫胰蛋白酶消化法，每隔30min收集一次細胞，而不是將組織一直浸泡在胰蛋白酶中(3~4h)等待其全部消化。
    與溫消化相比,冷消化可獲得較高的細胞存活率,培養(yǎng)24h 后生存率也提高。同時可保留更多的細胞種類。
    例如，經冷消化處理的小鼠胚胎培養(yǎng)物含有更多的上皮細胞。冷消化也很方便，因為不用攪拌和離心，在4度條件下過夜即可。然而，這種方法受限于一次可處理的組織量。
    膠原酶處理
    如果組織含有大量纖維成分，又對胰蛋白酶非常敏感而不能使用胰蛋白酶消化的話。常用的是用膠原酶來消化處理。例如人的腫瘤組織、小鼠腎臟。
    使用膠原酶消化的過程比較慢但比較緩和，無需機械振蕩和特殊設備。對于大于1g 的組織，由于消化時間過長，費用也會非常高，因為需要大量的膠原酶。
    膠原酶可解離大多數(shù)結締組織，但存在成纖維細胞過度生長的問題，故需要再進行選擇性培養(yǎng)或進行細胞分離。
    機械法處理
    最后，就是機械法解離細胞。有幾種操作可以通過機械解離收集到細胞：
    • 切碎或“溢出"，切割作用或被切表面的破損使細胞釋放出來
    • 篩網擠壓，用注射器芯將組織擠壓過篩網
    • 注射器吸打，將組織吸入注射器中，通過-個大孔徑的針頭或導管將液體快速打出
    • 用吸管打碎，用大孔徑的吸管吸取組織塊上下吹打
    適用于機械解離的樣本僅僅是較軟的組織，如脾、胚肝、胚腦、成年腦或部分人和動物的軟質腫瘤。
    對于腦，即使易于做到全部分解，然而與酶消化的結果相比，雖然花費的時間較少，但懸液中存活的細胞數(shù)也少。
    若組織取材不受限，細胞數(shù)量無關緊要，在短時間內機械法可產生與酶消化同樣多的活細胞，但這種方法要消耗更多的組織，同時，死細胞可通過離心而去除。
    總結
    分離組織并進行原代培養(yǎng)，是特殊功能細胞培養(yǎng)的第一個也是最重要的階段。
    若在這一階段細胞丟失了，則是不可補救的。因此，我有2個建議給大家：
    1 原代細胞存活率較低，因此接種密度可以比常規(guī)的細胞系要更高，營養(yǎng)條件也可以適當提高，例如采用胎牛血清而不是小牛血清進行培養(yǎng)。

    2 不同種類的細胞應采用相應的解離方法，例如，胰蛋白酶比膠原酶作用強，建立單細胞懸液更高效；膠原酶不能解離上皮細胞，但這一特性成為它的一個優(yōu)點，可利用它使上皮細胞與間質細胞分離并保持上皮細胞團的活力。機械法比酶消化法快，但對細胞損傷大。

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